中国生物工程杂志 2003.7 Vol 23, No.7
李洪清 1 李美茹 2 潘小平 2 陈贻竹 2
（ 1 华南师范大学生命科学院广州 510631 2 中国科学院华南植物研究所广州 510650 ）
摘要 1987年世界首例成功运用转基因技术改造矮牵牛花色以来，花色改造基因工程技术不断被证明其在培育新花色品系上的无穷魅力。本文介绍了近年来运用基因工程技术成功改造花色的主要三种策略：1. 采用反义RNA及共抑制的方法来改变花颜色的深浅；2. 通过导入新基因产生新奇花色；3. 利用转座子构建特殊表达载体，随机激活花色合成的基因来产生嵌合花色。另外，本文还对转基因株花色不稳定原因进行了讨论。
关键词 花色花色素苷基因工程
花是观赏植物的主要观赏器官。自然界花色种类繁多，但一些重要花卉却色彩有限，如月季、郁金香、康乃馨缺少蓝色和紫色；非洲紫罗兰、仙客来、天竺葵、矮牵牛缺少纯黄色；鸢尾、紫罗兰等缺少红色和砖红色，这些是运用传统杂交育种方法无法解决的问题。因此，对花色基因的研究具有重要的意义，一方面使人们有可能对花色进行人工修饰，进一步提高其观赏和商品价值；另一方面，由于花色的明显可见性，花色基因可作为看得见的标记基因，用于研究基因的表达、调控等。
花色素苷是影响花的主要色素，控制花从红色至紫色、蓝色的一系列变化，其含量的增高或降低都可能改变着花的颜色。目前对属于类黄酮的花色素苷的合成代谢以及与之相关的基因研究得较为深入，而且已被应用于改造花色的研究中。下面将介绍成功进行花色改造的基因工程技术和成果。
1 花色变淡
导入植物内源色素基因的反义 (antisense)基因或正义（sense）基因, 抑制内源色素基因的活性，造成无色底物的积累，使花色变淡或变白。
1.1 反义RNA技术（antisense suppression）
将某一基因反向插入植物表达载体，然后导入植物体内，这种“错误”的 DNA转录成RNA之后，与内源的互补mRNA结合，使mRNA不能合成蛋白质，以此达到抑制靶基因表达的目的，也即达到修饰目标性状的目的，实现花色的改变。1988年，vander Krol等 [1] 首先采用此法获得了矮牵牛花色变异新品种，他们将编码查尔酮合成酶 (chalcone synthase，CHS)的结构基因反向导入矮牵牛植株，转基因株的花色由紫色变成白色，且不同株系表现出不同程式的花色变异。Aida等 [2] 分别将反义 DFR ((dihydroflavonol 4-reductase)和 CHS 导入蓝猪耳中，转基因株系的花冠花色素苷含量均呈不同程度的减少，结果产生多种新花色图案，如花冠檐上深着色部分呈波浪形或某些唇瓣着色较深。转反义 CHS 的株系，花筒和花冠檐的花青素苷色均同等程度减少，花颜色趋于红色；而转 DFR 基因株系冠檐的花色素苷含量减少程度比冠筒的大，转化株因积累了大量的黄酮、黄酮醇物质，因而转化株花的颜色显得更蓝。一般而言，采用反义 RNA技术转化结构基因，均在不同程度上减少花青素苷的含量，花色也相应的变淡。该方法也已成功地应用于改造其它多种花色上 [3，4] 。
1.2 共抑制法（sense suppression或cosuppression）
即通过导入一个（或几个）与内源基因同源或异源（但序列应与内源基因具高度同源）基因，达到抑制该内源基因转录产物的积累，进而抑制该内源基因表达的技术。共抑制现象是于 1990年Jorgenson教授实验室 [5] 发现的，他们本想将 CHS 导入矮牵牛，通过 CHS 在细胞中的超表达（ overexpression）加深花的颜色，但实验结果出乎他们的设想。转化株的花色素苷合成受到抑制，42%的转化株产生完全白花和紫白嵌合花。但转化株花色的遗传不稳定。现在共抑制现象已在多种植物上发现并被应用于基因功能、基因活性网络调控上的研究。Aida等 [6] 分别将 DFR 和 CHS 导入蓝猪耳中，转基因株系的花冠花色素苷含量均呈不同程度的减少，位于花筒的花色素苷含量减少程度大于花冠檐，花筒的颜色几近白色。发生共抑制与导入基因的拷贝数以及两个基因之间的同源性程度密切相关 [7，8] 。在矮牵牛的花冠组织中有两个 CHS 基因： CHS-A 的 mRNA约占90%， CHS-J 的占 10%，这两个基因在编码区处具85%的同源性。导入 CHS-A 编码区的开白花的矮牵牛中，不仅 CHS-A 被抑制而且 CHS-J 也被抑制。这说明产生共抑制并不需要两个基因序列完全相同。菊花的 CHS 和 DFR 基因与矮牵牛的具 70%的同源性。当将来源于矮牵牛的 CHS 导入矮牵牛中， 48个转化株中有8株出现的共抑制现象，而换成来源于菊花的 CHS ，则在调查的 97株转化株中，没有发现有共抑制的现象。改用 DFR 也得到同样的实验结果 [7] 。转化的品种也影响了共抑制的发生， Huits等 [9] 发现矮牵牛的 dfr A 基因导入矮牵牛 W80和W85后，不同品种的转化株花色改变程式不同，发生在W85株系中的嵌合花色更多。最近，Shimada等 [10] 将矮牵牛的 F3 ' 5 ' H 基因导入细胞中存有 F3 ' 5 ' H 基因的矮牵牛（ vars. Falcon Blue, Cascade Royal，花为深蓝色）中，发现转基因植株的花为淡蓝、淡红色，推测这是由于外源基因与内源基因通过共抑制，降低或抑制了 F3 ' 5 ' H 基因的表达引起的。反义 RNA技术和共抑制技术在改变花色显现上有明显的区别。Jorgensen等 [8]
比较了转反义 CHS 和正义 CHS 矮牵牛株系花颜色的变化，发现转反义 CHS 仅影响花冠的颜色，但转正义 CHS 不仅影响了花冠的颜色，而且影响了花药、茎和叶的颜色，特别是影响了花筒的颜色。两者所产生的新花色图案也不同，导入反义 CHS 产生白色区，白色区域从花筒幅射到冠檐，而导入正义 CHS 的株系，则在冠檐上产生白色的楔形或波浪形。 Aida等 [6] 在蓝猪耳上也观察到了同样的现象，即转正义CHS 或 DFR 显著减少了花色素苷在花筒的积累。这同时也说明了相同基因在矮牵牛和蓝猪耳上发生共抑制的部分机理是相同的。
2 增加新花色
将欲修饰的供试株及其近缘种植物中原先没有的基因导入其中，从而使该受体植物增加一个或几个新的性状。将该原理应用于花色基因工程操作上，可以产生新奇花色。 DFR 分别将 dihydrokaempferol(DHK，香橙素)、dihydroquercetin(双氢槲皮素)、dihydromyricetin(双氢杨梅树皮素)还原成相应的leucopelargonidin、leucocyanidin和leucodelphinidin。这些都是花青素的前体。矮牵牛的 DFR 不能将 DHK作为底物，只对双氢杨梅树皮素有还原作用。因此，在矮牵牛中，存在有花青素和翠翟素的衍生物，但缺少天竺葵的衍生物。矮牵牛突变种RL01积累大量DHK， Ht1 和 Hf1 双稳性，缺少 F3 ' H活性，只有极低的F3 ' 5 ' H活性，含极少量的花青素和花翠素衍生物，无天竺葵青的衍生物，花近白色。玉米编码DFR基因 A1 能将双氢槲皮素催化成花青素衍生物。 Meyer等 [11] 将 A1 基因导入 RL01中，转化株积累了天竺葵糖苷，没有DHK，花为砖红色。这也说明了来源于玉米的 A1 基因编码的 DFR酶不象矮牵牛的DFR酶一样，对底物极其专一。但以上获得的转化株花颜色极不稳定，最终花呈多种颜色，如白色、杂色和红色。Elomaa等 [12] 比较了来源 A1 基因和非洲菊 DFR（ gdfr ）基因在 RL01中的表达情况，发现转 A1 基因的植株花颜色较淡，且随生长发育时间发生变化，这与导入 RL01多拷贝基因和35s启动子和 A1 cDNA发生甲基化有关。转 gdfr 基因的植株，花色泽深且稳定，这与 gdfr cDNA中GC含量低，不易发生甲基化有关。Davies等 [13] 将苜蓿 CHR （ chalcone reductase）导入矮牵牛，发现转化株花的颜色从白色变为黄色，这是因为转化株中积累了大量6 ' 脱氧查尔酮的缘故。转辣椒红素合成酶基因的烟草植株，叶片中由于积累在辣椒红而呈红色 [14] 。来源于单细胞绿藻 Haematococcusplusvialis 的编码 a -胡萝卜素酮酶基因，被定向导入烟草蜜腺组织后，改变了转化株胡萝卜素生物合成的途径，在蜜腺组织中产生了虾青素，该组织的颜色也相应地从黄色变为红色 [15] 。
理论上可以通过超表达某一结构基因，以增强原有代谢产物的表达，达到加深花器官花色素苷的含量。但目前该方法在改造花色研究中尚无成功的报道。结构基因的活性由调节基因控制，目前已分离的调节基因多来自玉米。当植物组织由于缺乏调节基因表达产物而不能激活结构基因时，可以通过导入调节基因来改变花色。 Lloyd等 [16] 将玉米的调节基因 R 和 C 导入拟南芥和烟草中，两种植物的转化株花色均由白色变为不同深浅的粉红色。
在观赏植物中，花卉的蓝色品系非常罕见，尤其是那些名贵花卉，如月季、百合、郁金香、香石竹、菊花等均缺乏蓝色的品种。人们期望将编码 F3 ' 5 ' H 基因引入缺乏 F3 ' 5 ' H 基因的玫瑰、香石竹中，使原合成花葵素苷和花青素苷的代谢方向转向翠雀素糖苷的合成方向，从而使花变为蓝色花 [17] 。 Florigene公司将矮牵牛的 F3 ' 5 ' H 基因和 Dfr 基因导入白花的康乃馨中，转化株积累了大量的花翠素，花色也因而发生了改变，改变程度与导入的基因的表达强度相关。该公司现已得到两个商品的品系，分别为 Mondust TM （花为淡紫色）和 Moonshadow TM （深紫色），先后在 1996年和1997年投放到市场。最近该公司报道将 F3 ' 5 ' H 基因和 CYTPb5 基因同时导入康乃馨中，花色从原来对照株的红色转变为深紫色。但细胞中含有高含量的花翠素并不意味着花瓣就能呈现理想的蓝色 , Shimada等 [9] 将来源于龙胆的 F3 ' 5 ' H 的 cDNA---- TG1 导入开粉红色花的烟草（ Nicotana tabacum cv. PetitHavana SR1，该植物缺少F3 ' 5 ' H酶），同时还将来源于矮牵牛的F3 ' 5 ' H酶的cDNA---- AK14 导入矮牵牛（ var.Falcon，该植物缺少F3 ' 5 ' H酶，花呈粉红色）中，转化株均积累了花翠素的衍生物，花色从粉红变为洋红，在所有的转化株中均没有蓝色的花。花翠素的含量在转基因的矮牵牛中远高于在转基因的烟草中。在转基因的矮牵牛中，花色图案也发生了变化，出现新的星型图案。蓝色花的形成除与液泡中的色素有关外，还与助色素、金属离子、液泡的pH值密切相关，人们正在从影响蓝色花形成的诸多因素中找到培育蓝色玫瑰等花卉的突破口 [17] 。
3 嵌合花色
嵌合花色具有很高的观赏和商业价值，自然界中部分嵌合花色是由于转座子引起的。利用转座子插入法可一次获得较多种类的突变体，例如 van Houwelingen等 [18] 利用内源转座子（ TEs ）插入矮牵牛，获得 55个新的花色突变体。转座子通过插入或割离目的基因而关闭或恢愎基因的表达活性。由于不同细胞中转座子跳出的时间不同，因而不同细胞中的目的基因的表达时空不同，如果被转座子影响的目的基因是与花色素合成有关的结构基因或调节基时，则不同细胞中的结构基因表达的时空不同，因而在不同细胞中生成的花色素苷不同，导致在同一花瓣上可能显现不同的颜色，形成美丽的嵌合花色。例如，在构建玉米 Lc 基因的表达载体时，在 Lc 基因编码区和 CaMV 35S 启动子之间插入转座子 Ac ，转化番茄，由于 Ac 跳出之后， Lc 基因的表达导致在番茄的叶子和果实上产生深红色的斑点 [19] 。
2001年Liu等 [20] 首次构建了一个转录因子 R 的表达载体，在启动子 CaMV 35S 和 R 基因之间插入一个来源于拟南芥自主性的转座子 Tag1 ， R 基因调节花色素苷合成途径中的多个结构基因（如 CHS 、 DFR 、 UFGT 、 F3H 、 CHI 等）的表达。实验表明转基因的烟草的花产生多种美丽的嵌合花色。
4 问题与展望
虽然第一例利用基因工程技术改造花色是 1987年诞生的，距今已有10多年，这其中，也已在多种植物上成功地进行了花色基因工程技术操作，但至今我们仍很难随心所欲地进行花色的控制。究其原因，主要是因为花色的形成受多种因素的影响，例如，在一些植物中蓝颜色是翠雀素与适当的因素如助色素、金属复合物、液泡pH值等相互作用而产生 [17] 。这就是为什么虽然最早分离转化 F3 ' ,5 ' H 基因，进行培育蓝色月季的研究始于 1993年，但至今还未有成功培育蓝色月季报道的原因。Forkmann [21，22] 将影响花色显现的有关花色基因分为以下几类：（ 1）控制黄酮类生物合成单个步骤的基因；（2）与黄酮类修饰有关的基因；（3）开关全部或部分合成途径的调节基因；（4）影响黄酮类浓度的基因（增强或减弱色素合成；阻止色素积累；引起酶促或化学褪色）；（5）与花朵特定结构有关的基因（花瓣特定部位色素不同的产生或积累，花嵌合体的形成；转座子引起的基因不稳定表达）（6）影响花色的基因或因子（共着色；黄酮类与金属离子的互作；液泡pH值）；（7）控制花瓣毛、乳突、色素细胞的形状和分布、角质层类型等形态特征的基因。因此，也许随意操作以上花色基因的表达，将影响着花颜色的表达。
目前我们对于三大类色素生物合成途径产生色素变化的认识仍然有限，花颜色形成过程的调控很复杂，而且有多种因子的同时参与。而且转基因在植物细胞内的多种表现（如激活、沉默等）很难控制，这可能是迄今为止所进行的改变花色的遗传操作存在不稳定性的原因所在。实验表明转转录因子的植株，特别是由于转座子对基因表达活性的影响，使花色变异程度很大 [18，20] 。花色素基因分子调控途径的研究是目前花色基因工程的研究热点。
虽然目前距离定向花色育种的实践应用仍有一定的距离，但从已知实验结果表明了基因工程技术操作使花色变异大，这意味着通过此途径易获得新花色品系，这一点正符合观赏植物产业追求新奇异目的的需求。总之，随着基因活性调控机理的揭示和基因工程操作技术的进步，花色基因工程将展示更有广阔的应用前景。
参考文献
[1] van der Krol A R, Lenting R J, Veenstra J G, et al . An antisense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Nature , 1988, 333:866-869.
[2] Aida R, Yoshida K, Kondo T et al . Copigmentation gives bluer flowers on transgenic torenia plants with the antisense dihydroflavonol1-4-reductase gene. Plant Sci ,2000, 160 :49~56.
[3] Mitiouchkina TY, Ivanova, EP，Taran SA，et al. Chalcone synthase gene from antirrhinum majus in antisense orientation successfully suppressed the petals pigmentation of chrysanthemum. Acta Hort . 2000, 508:215-218
[4] Elomaa P, Hnkanen J, Puska R, et al. Agrobacterium -mediated transfer of antisense chalcone synthase cDNA to Gerbera hybrida inhibits flower pigmentation. Bio/Technol 1993,11: 508-511
[5] Napoli D, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell 1990,2:279-289
[6] Aida R, Kishimoto S, Tanaka Y et al. Modification of flower color in torenia(Torenia fournieri Lind.) by genetic transformation. Plant Sci ,2000, 153 :33~42.
[7] Gutterson N. Anthocyanin biosynthetic genes and their application to flower color modification through sense suppression. Hort Sci,1995,30:964-966
[8] Jorgensen RA, Cluster PD, English J et al. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense versus antisense constructs and single-copy versus complex T-DNA. Plant Mol Biol,1996,957-973
[9] Huits HSM, Gerats AGM, Kreike MM, et al. Genetic control of dihydroflavonol 4-reductase gene expression in Petunia hybrida. Plant J,1994,6:295-310
[10] Shimada Y, Nakano-Shimada R, Ohbayashi M et al. Expression of chimeric P450 genes encoding flavonoid-3 ' 5 ' -hydroxylase in transgenic tobacco and petunia plants. FEBS Lett ,1999, 461 :241~245.
[11] Meyer P, heidmann I, Forkmann G， et al . A new petunia flower color generated by transformation of a mutant with a maize gene. Nature , 1987, 332:677-678.
[12] Elomaa P, helariutta Y, Griesbach RJ, et al. Transgene inactivation in Petunia hybrida is influenced by the properties of the foreign gene. Mol Gen Genet,1995,248:649-656
[13] Davies K, Bloor S. Spiller GB, et al. Production of yellow colour in flowers: redirection of flavonoid biosynthesis in Petunia. Plant J,1998,13:259-266
[14] Kumagai MH, Keller Y, Bouvier F, et al. Functional integration of non-native carotenoids into chloroplasts by viral-deriver expression of capsanthin-capsorubin synthase in Nicotiana benthamiana. Plant J,1998,14:305-315
[15] Mann V, Harker M, Pecker I, et al. Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers. Nature Biotechnol,2000,18:888-892
[16] Lloyd A M, Walbot V, Davis R W. Arabidopsis and Nicotiana anthocyanin production activated by maize regulatiors R and C1. Science, 1992, 258:1773-1775.
[17] 李美茹，李洪清，孙梓键等。影响蓝色花着色的因素问题。植物生理学通讯,2003, 39(1):51-55
[18] van Houwelingen A, Souer E, Spelt K et al. Analysis of flower pigmentation mutants generated by random transposon mutagenesis in Petunia hybrida. Plant J,1998,13:39-50
[19] Goldsbrough AP, Tong Y, Yoder JI. Lc as a non-destructive visual reporter and transposition excision marker gene for tomato. Plant J,1996,9:927-933
[20] Liu D, Galli M, Crawford NM . Engineering variegated floral patterns in tobacco plants using the Arabidopsis transposable elements Tag1. Plant Cell Physiol,2001.42(4):419-423
[21] Forkmann G. Flavonoids as flower pigments: the formation of natural spectrum and its extension by genetic engineering. Plant Breeding,1991,106:1-26
[22] 刘青林，陈俊愉。观赏植物花器官主要观赏性状的遗传与改良。园艺学报，1998，25：81-86
The Progress in Genetic Modification of Flower Color
Li Hongqing 1 Li Meiru 2 Chen Yizhu 2
(1 College of Life Sciences, South China Normal University , Guangzhou 510631
(2 South China Institute of Botany, Guangzhou 510650)
Abstract The first novel colored flowers of Petunia in the world were obtained by genetic engineering in 1987. Since then, different methods were developed for flower color manipulation. In this paper, we reviewed the three effective methods successfully used in developing novel colors: 1. Changing flower colors by anti-sense and sense suppression technology. 2. Creating novel flower color by expression of new foreign genes. 3. Making variegated flower color by random activation of anthocyanin gene expression through transposon strategy. Finally, the problems and perspectives of genetic engineering of flower color were discussed.
Key words Flower color Anthocyanin Genetic engineering Transponson